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β-甘露聚糖酶在植物乳杆菌中的组成型表达与表面展示

01

文章背景简介

BACKGROUND INTRODUCTION

甘露聚糖酶能随机催化水解含有β-1,4甘露糖苷键的β-1,4甘露聚糖、葡甘露聚糖及半乳甘露聚糖生成甘露寡糖。已有研究证明,甘露寡糖对人和家畜的健康具有促进作用。

研究表明,甘露聚糖酶能够利用诱导型表达载体pSIP在植物乳杆菌中有效的生产和表达。但是在进行游离酶的分离纯化时酶容易被破坏。此外,蛋白质的化学固定化也是一个费力并且有害的过程,存在一些缺点,如酶活性的回收率低,在反应过程中酶活逐渐丧失、一些固定化酶与底物之间传质阻力大……等等。因此,在所谓的基因固定化中,利用细菌作为固定化基质,合成与锚定基序融合的蛋白质,然后将其锚定在细菌细胞表面,很容易从培养中获得固定化酶。这种方法通过让细胞完成整个过程,实际上克服了游离酶或传统固定的许多限制。此外,表面展示酶在恶劣条件下具有很高的耐受性或稳定性,特别是当蛋白质嵌入细菌细胞壁时,可以在多个工艺循环中重复使用。

深入了解不同锚定基序的作用机制,将对乳酸菌细胞表面系统的研究和开发具有食品和生物技术应用价值的酶的固定化具有重要意义。原则上,一种外源蛋白主要可以通过两种策略附着到乳酸菌细胞的包膜上,一是采用锚定脂蛋白或利用sortase酶途径与细胞膜或细胞壁以共价键附着在一起。另外则可以采用一个蛋白质域以非共价的方式与细胞壁或膜的成分形成强烈相互作用。

针对与食品相关的应用,使用可诱导的乳酸菌表达载体(需要在培养培养基中添加合成诱导剂)可能不是首选。此外,诱导表达系统不适合在与人体内进行治疗,也不适合应用于酶制剂的原位生产中。因此,使用组成型表达载体生产蛋白质将是一种不错的选择。

越南岘港大学生物技术系的Nguyen等人2019年在《Microbial Cell Factories》杂志上(IF 2018=4.402,生物工程与应用微生物2区)发表了题为“Constitutive expression and cell-surface display of a bacterial β-mannanase in Lactobacillus plantarum”的文章。在该研究中,作者研究了两个组成型启动子:来自嗜酸乳杆菌NCFM的Pgm启动子和嗜酸乳杆菌ATCC4356的SlpA启动子,随后利用这两个启动子在植物乳杆菌WCFS1中表达含有脂锚定蛋白Lp_1261的β-甘露聚糖酶。这些组成型启动子被证明是乳酸杆菌胞内产生外源蛋白的强启动子,但是利用这些启动子在细胞外表达和在细菌细胞表面显示外源蛋白的研究尚未见报道。因此,对这些活性甘露聚糖酶表面展示的组成型启动子的功能进行评估,可能为开发安全的、食品级的全细胞生物催化剂铺平道路,这些催化剂可用于生产促进健康的低聚糖。

02

所用到的主要方法

METHODS

(1)质粒构建

(2)凝胶电泳和Westernblotting

(3)流式细胞术和间接免疫荧光显微镜分析

(4)薄层色谱

(5)高效阴离子交换色谱(HPAEC)

03

文章主要内容摘要

ABSTRACT

由于乳酸菌的食品级地位和益生菌的特性,一些乳酸菌被认为是安全有效的细胞工厂。本研究旨在对地衣芽孢杆菌DSM13的一种甘露聚糖酶进行组成型表达,该酶随后被展示在植物乳杆菌的细胞表面,用于寡糖生产的全细胞生物催化剂。来自嗜酸乳杆菌NCFM和嗜酸乳杆菌ATCC4356的两个强组成性启动子,Pgm和SlpA,分别取代乳酸杆菌pSIP表达系统中的诱导启动子进行载体构建。作者将甘露聚糖酶编码基因(manB)与植物乳杆菌N端脂锚定蛋白(Lp_1261)融合并克隆到组成型pSIP载体中,在植物乳杆菌WCFS1中进行了表达。然后,通过流式细胞术和免疫荧光显微术实现了对该蛋白在细菌细胞表面的定位,并对构建的植物乳杆菌细胞表面甘露聚糖酶活性和重复利用度进行了评价。结果显示:在Pgm和SlpA启动子的控制下,植物乳杆菌细胞表面获得的甘露聚糖酶活性最高,分别为1200 U/g和3500 U/g干细胞重量,分别比诱导的pSIP锚定载体所获得的活性高2.6倍和7.8倍。表面展示的甘露聚糖酶能够将半乳甘露聚糖降解成甘露寡糖。本研究使用的方法,利用强大的组成型启动子,使一种β-甘露聚糖酶在植物乳杆菌细胞表面实现了组成型表达和表面展示,这将有助于实现重组蛋白在无需添加诱导剂或改变宿主菌株生长条件下进行持续地合成。

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