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如何用超分辨显微镜观察染色质?

“纠缠”在一起的DNA被压缩在细胞核内,想对核内复杂的环境进行观察是个困难的事情,整理分享一篇用超分辨显微镜观察染色质的文章,具体内容如下:

细胞核内DNA并不独立自由的存在,而是以特定的方式压缩:DNA缠绕组蛋白形成核小体(nucleosome);串联的核小体进一步压缩成染色质(chromatin);细胞分离时,染色质会压缩成染色体

用核酸染料(SYTOX Green或DAPI)对核内进行染色,SIM超分辨进行观察,发现核内DNA呈海绵状,有的地方DNA密集(白色区域),有的地方没有DNA(黑色),作者将DNA密集区定义为CD(chromatin domain染色质区域),将没有DNA的黑色区域定义为IC(inter-chromatin compartment 染色质间隙),IC与核孔相连

染完DNA“染”组蛋白用于反映染色质:DNA和组蛋白共定位;除了在固定细胞上看染色质,为了排除固定对细胞核状态的影响,又在活细胞上看了染色质状态 – 依然是IC与CD黑白相间的海绵状

进一步用EU掺入法标记出RNA,发现RNA和DNA“互斥”,暗示RNA分布在IC区

超分辨看完又用电镜看细胞核内染色质(和SIM想法,在电镜图上黑色反映高密度区,黑色的是染色质)

对电镜图进行分析,发现电镜图和SIM图观察出的染色质状态一致

作者以“麻麻咧咧”的细胞核SIM超分图为根据地,观察各种已知的变量在CD区和IC区的分布,首先是看TAD(topologically associating domains):TAD是染色质折叠出的空间结构,通过测序技术3C/Hi-C,能找到DNA片段上相关序列


首先看了一个已知的在X染色体上的TAD位点,FISH标定出了TAD(红色点),分析TAD和CD空间关系发现两者相邻、严密契合

看其他TAD,依然是分布在CD区周围

接下来作者看了各种组蛋白修饰、染色质结构相关蛋白、RNA相关蛋白在CD或IC的分布。首先,作者自己制定了一套量化标准,根据蛋白在IC-CD之间的分布情况分为7级:在IC定义为1,在CD定义为7

可见异染色质、沉默基因相关组蛋白分布在CD区,离IC区较远;活动的基因、RNA相关蛋白、染色质结构相关蛋白分布在CD区外。和这些蛋白、基因的行为一致,活动性差的就在比较紧密的CD区内,不对外开放;活动性强的则在紧密的CD区外,便于实现相关功能 - 说白了就是看图说话,数据展示用热图,这样比较炫酷

再进一步,作者还发现,在CD区或离CD区越近(如紫色标记的6级),分子量越小 – CD区比较紧密,需要“瘦小的身材” – 充分发散故事,增加文章丰富性

CD和IS一个很大的区别在于紧密度,CD区很致密,作者选了一个致密的DNA需要打开的情景 – 细胞周期中需要进行DNA复制的S期:EdU会掺入正在复制的DNA,可见S期早期EdU主要分布在CD区外,随着S期进展,到S期晚期,CD区内EdU增加

致密的CD区由压缩的染色质折叠而成,CTCF和cohesin调节染色质的折叠、DNA loop挤出(如左图),作者做了一个可诱导敲除cohesin亚单位RAD21的细胞系,想看看敲掉调节染色质折叠的蛋白RAD21后CD和IS的变化

可以看到,敲掉RAD21后,CD、IS分布并未受到影响,组蛋白的分布、量也没发生变化,暗示染色质3D结构、表观层面没发生显著变化,并不依赖cohesin

作者主要关注的是致密的染色质组成的CD区,SIM和电镜图向我们展示了CD区。为了便于和电镜图比对,SIM图颜色做了反转,本该是白色有强荧光信号的CD区成了黑色,能看到,两项技术对CD区的呈现类似,电镜由于分辨率更高,让我们看到了CD区内的细节。基于前面的数据,能推出致密的CD区处于抑制状态,CD区周围活动着各种DNA、RNA相关事件,如复制、转录,在DNA复制时,致密的CD区会“打开”

文章真的一点也不复杂,核酸染料染个细胞核,再加几个抗体染蛋白,而后就是拍片子。电镜用于锦上添花,不需要太多图,关键在于会讲故事、会呈现数据……

Ezequiel Miron, Roel Oldenkamp, Jill M. Brown, David M. S. Pinto, C. Shan Xu, et al. Chromatin arranges in chains of mesoscale domains with nanoscale functional topography independent of cohesin [J] Science advances, 23 September 2020.

参考文献:

Weimin Wang, Michael Green, Jae Eun Choi, Miguel Gijón, Paul D. Kennedy, et al. CD8+ T cells regulate tumour ferroptosis during cancer immunotherapy [J].Nature, 2019.

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