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非肿瘤生信:5+分新思路

2020-12-29 08:53
科研菌
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大家好,今天生滚粥跟大家分享一篇5+分的学习笔记。文末阅读原文可获得学习笔记。

题目:植入前胚胎发育的可变剪切特点

一、研究背景

植入前胚胎发育在胎儿发育中起着至关重要的作用,需要精确的时空控制基因表达,所以对于胚胎发育中基因表达的分析显得至关重要。随着近年来RNA测序技术的发展(特别是单细胞RNA测序),有关植入前胚胎发育的研究也不断取得突破。

可变剪切(AS)即一条未经剪接的RNA,含有的多种外显子被剪成的不同组合,可翻译出不同的蛋白质。已有的研究表明,可变剪切对细胞的生长发育起着关键作用。

二、分析思路

三、结果解读两细胞阶段是植入前胚胎发育中基因转录的关键阶段

正如研究背景中说到的,可变剪切在基因的表达过程中起着关键作用。首先探究了胚胎发育过程中转录的关键阶段,通过利用RNA-seq数据、STAR软件,获取了不同阶段表达的基因数目;同时,根据基因表达(FPKM),确定了植入前胚胎发育中差异表达的基因(图一)从图一的结果可以看到,两细胞阶段基因表达量最高,这提示两细胞阶段可能是转录的关键阶段。

图1:不同阶段基因的表达数目

为了鉴定在两细胞阶段特异性表达的基因,使用了模糊c-均值(FCM)方法对植入前胚胎发育的RNA-seq数据进行分析。将表达的基因分为8类,其中在第2类中鉴别出了1415个基因(这代表这些基因在两细胞阶段特异性表达,见图2)并对这些鉴别出的基因进行GO分析(分析结果见图3左图)

既往报道显示两细胞阶段是染色质开始构建拓扑关联域(TAD)的时刻,在第2类中发现了CTCF(CTCF被认为与拓扑关联域的构建有关),为下一步作了铺垫。(图3右图)

图2:基因表达的聚类

图3:GO分析以及CTCF的表达情况

植入前胚胎发育过程中可变剪接的动态变化

在得到关键阶段后,开始研究文章的主要话题:可变剪切。发现两细胞阶段和合子阶段的基因表达情况与RNA剪切密切相关(图4)

图4

为了说明剪切在胚胎发育过程中的具体作用,使用拼接百分比(PSI)来测量与剪接点对齐的读取比例,根据PSI将基因分为了损失和增益两组。热图(图5)显示了PSI在植入前胚胎发育中动态变化,表明可变剪切在植入前胚胎发育中广泛存在。此外,还发现两细胞阶段的可变剪切数目最多。

图5:不同阶段PSI的情况

两细胞阶段的可变剪切

在说明两细胞阶段是关键阶段且可变剪切在该阶段数目最多之后,开始进一步研究该阶段可变剪切的具体情况。使用Venn图鉴定了695个在两细胞阶段发生AS的基因,并利用STRING得到了PPI网络,该网络可分为9个模块。

图6:Venn图和PPI网络

在这些基因中,重点关注了 Smarcb1,因为该基因被报道与染色质重塑有关。外显子计数表明大多数AS发生在7-9、13-27和23-27外显子上,后者对应于SMARCB1 CDS的3'端;而该基因的C末端结构域(CTD)中存在突变会导致人类细胞中主要基因调控和形态的改变,这反过来提示这些不同的亚型可能在染色质重塑的调节中起作用。(外显子计数结果见图7)此外,GO分析显示这些基因与DNA / RNA过程和细胞周期高度相关,提示他们可能与接下来的增殖分化有关。

图7:外显子计数和GO分析结果

植入前胚胎发育中可变剪切类型的差异

利用rMATs(一款对RNA-Seq数据进行差异可变剪切分析的软件),检测每个阶段可变剪切的类型,分为5类:跳过外显子(SE),替代5'剪接位点(A5SS),替代3'剪接位点(A3SS),互斥外显子(MXE)和保留内含子(RI),并发现SE和MXE类型在AS中占很大比例且这两种类型在两细胞阶段十分丰富(这也与前面所说的“两细胞阶段是可变剪切的重要阶段”印证)

图8:不同阶段可变剪切的类型

此外,AS基因在两细胞阶段和其他阶段的表达明显不同(图4c),也支持了之前的发现(图9)

图9:AS相关基因在不同阶段的表达

两细胞阶段可变剪切与TAD有关

据报道,TAD在两细胞阶段开始形成,染色质开始重塑。为了研究染色质组织的动态变化是否与AS相关,分析了Hi-C两细胞阶段的数据,在3628个基因中发现了691个位于TAD的AS相关基因,结果表明,TAD中发生了大量AS。以Smc4为例(图10左),其中蓝色代表A compartment,橙色代表B compartment;下面则是Smc4在合子期和两细胞阶段的表达情况。

为了确认AS在TAD中特异性富集,计算了绝缘分数(IS),更高的IS表明AS在TAD中特异性富集。然后在全基因组范围内分析了AS的发生频率,circos plot显示,AS在TAD中富集,但与A / B compartment无关(从外到内的圆圈依次代表A / B compartment,密度,TAD边界和IS得分)。

图10:Smc4(左)circos plot展示AS在全基因组的发生频率(右)

小结

首先证明,在植入前胚胎发育的阶段中,两细胞阶段具有更高数量的表达基因。在此基础上,确定了在两细胞阶段高表达的基因簇,并在该阶段检测可变剪切的类型,发现可变剪切在两细胞阶段发生频率较高。最后,发现AS与染色质结构有关且在TAD中尤为常见。所以,植入前胚胎发育的转录过程大致为:一些与染色质结构相关的基因的转录被启动,以促进两细胞期TAD的形成,然后这些TAD进一步促进其他细胞发育相关基因的转录--构成一个自我调节的环路。

声明: 本文由入驻维科号的作者撰写,观点仅代表作者本人,不代表OFweek立场。如有侵权或其他问题,请联系举报。

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