BACKGROUND INTRODUCTION

利用丰富廉价的碳源可以有效降低生产成本，提高经济可行性。其中，醋酸盐就是一种非常有前途的碳源，通常以较高浓度存在于废物和生物质的水解产物中。

衣康酸学名为甲叉琥珀酸，亚甲基丁二酸，是不饱和二元有机酸。它含不饱和双键，具有活泼的化学性质，可进行自身间的聚合，也能与其他单体如丙烯腈等聚合；能进行各种加成反应，酯化反应和聚合反应，是化学合成工业的重要原料，也是化工生产的重要原料，可用作酸味剂、pH调节剂、金属螯合剂等。

在2004年，美国能源部将衣康酸评选为12种最具发展潜力的生物质来源平台化合物之一。衣康酸主要通过丝状真菌土曲霉（Aspergillus terreus）的发酵产生。然而，由于发酵过程复杂、菌体生长缓慢、蛋白酶系统复杂、发酵过程持续需氧量高、生产成本高、副产物难以控制，以及缺乏有效的基因工程工具等因素，导致土曲霉发酵生产衣康酸水平受到了限制，40余年里产量都没有明显的提升。随着基因工程、合成生物学及系统生物学的飞速发展，越来越多的研究者将目光聚焦于其他底盘细胞，将衣康酸合成途径构建在异源细胞中，如大肠杆菌、酵母细胞和谷氨酸棒状杆菌等，以期提升工业衣康酸的产能。

2018年，韩国浦项科技大学（Pohang University of Science and Technology）的Myung Hyun Noh等人，在《Biotechnology and Bioengineering》杂志（IF3．952；工程技术2区）发表了题为“Production of itaconic acid from acetate by engineering acid－tolerant Escherichia coli W ”的文章。

所用到的主要方法

METHODS

1．HPLC：采用高压输液泵将规定的流动相泵入色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。适用于溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性、热稳定性的限制，用途广泛。

2．LC－MS：质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。液质连用实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。

3．real－time PCR：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。该技术已经被广泛用于监测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异。

4．异柠檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）测定：ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm 下有特征吸收峰，监测340nm吸光度的减小速率可间接反应ICL 活性。

ABSTRACT

利用丰富廉价的碳源可以有效降低生产成本，提高经济可行性。醋酸盐是一种很有前途的碳源，可以实现经济有效的微生物转化过程。在这项研究中，作者设计了一种从醋酸盐生产衣康酸的大肠杆菌菌株。由于已知醋酸盐抑制细胞的生长，作者首先筛选出具有高度耐受醋酸盐特性的大肠杆菌菌株，并最终选择W菌株作为后续研究所用的宿主。随后，通过使用合成的启动子和5＇UTR（非翻译区）来过表达cad基因（编码顺乌头酸脱羧酶）获得WC菌株。然而，由于醋酸盐吸收低，WC菌株仅产生0．13g ／ L衣康酸。为了改善产量，进一步通过途径基因的过表达以及其失调来扩增乙酸（即醋酸）同化途径和乙醛酸分流途径。所得菌株WCIAG4在用醋酸盐为唯一碳源发酵88小时后，可产生3．57g ／ L衣康酸（理论最大产率的16．1％）。这一研究也表明：醋酸盐可以成为工程化大肠杆菌生物化学生产的潜在原料。