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《Biotechnol Bioeng》:耐酸性大肠杆菌利用醋酸盐生产衣康酸

BACKGROUND INTRODUCTION

利用丰富廉价的碳源可以有效降低生产成本,提高经济可行性。其中,醋酸盐就是一种非常有前途的碳源,通常以较高浓度存在于废物和生物质的水解产物中。

衣康酸学名为甲叉琥珀酸,亚甲基丁二酸,是不饱和二元有机酸。它含不饱和双键,具有活泼的化学性质,可进行自身间的聚合,也能与其他单体如丙烯腈等聚合;能进行各种加成反应,酯化反应和聚合反应,是化学合成工业的重要原料,也是化工生产的重要原料,可用作酸味剂、pH调节剂、金属螯合剂等。

在2004年,美国能源部将衣康酸评选为12种最具发展潜力的生物质来源平台化合物之一。衣康酸主要通过丝状真菌土曲霉(Aspergillus terreus)的发酵产生。然而,由于发酵过程复杂、菌体生长缓慢、蛋白酶系统复杂、发酵过程持续需氧量高、生产成本高、副产物难以控制,以及缺乏有效的基因工程工具等因素,导致土曲霉发酵生产衣康酸水平受到了限制,40余年里产量都没有明显的提升。随着基因工程、合成生物学及系统生物学的飞速发展,越来越多的研究者将目光聚焦于其他底盘细胞,将衣康酸合成途径构建在异源细胞中,如大肠杆菌、酵母细胞和谷氨酸棒状杆菌等,以期提升工业衣康酸的产能。

2018年,韩国浦项科技大学(Pohang University of Science and Technology)的Myung Hyun Noh等人,在《Biotechnology and Bioengineering》杂志(IF3.952;工程技术2区)发表了题为“Production of itaconic acid from acetate by engineering acid-tolerant Escherichia coli W ”的文章。

所用到的主要方法

METHODS

1.HPLC:采用高压输液泵将规定的流动相泵入色谱柱,对供试品进行分离测定的色谱方法。适用于溶解后能制成溶液的样品,不受样品挥发性、热稳定性的限制,用途广泛。

2.LC-MS:质谱分析是先将物质离子化,按离子的质荷比分离,然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。液质连用实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程,使样品分析更简便。

3.real-time PCR:是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。该技术已经被广泛用于监测细胞mRNA表达量的变化;比较不同组织的mRNA表达差异。

4.异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase,ICL)测定:ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸,乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD,NADH在340nm 下有特征吸收峰,监测340nm吸光度的减小速率可间接反应ICL 活性。

ABSTRACT

利用丰富廉价的碳源可以有效降低生产成本,提高经济可行性。醋酸盐是一种很有前途的碳源,可以实现经济有效的微生物转化过程。在这项研究中,作者设计了一种从醋酸盐生产衣康酸的大肠杆菌菌株。由于已知醋酸盐抑制细胞的生长,作者首先筛选出具有高度耐受醋酸盐特性的大肠杆菌菌株,并最终选择W菌株作为后续研究所用的宿主。随后,通过使用合成的启动子和5'UTR(非翻译区)来过表达cad基因(编码顺乌头酸脱羧酶)获得WC菌株。然而,由于醋酸盐吸收低,WC菌株仅产生0.13g / L衣康酸。为了改善产量,进一步通过途径基因的过表达以及其失调来扩增乙酸(即醋酸)同化途径和乙醛酸分流途径。所得菌株WCIAG4在用醋酸盐为唯一碳源发酵88小时后,可产生3.57g / L衣康酸(理论最大产率的16.1%)。这一研究也表明:醋酸盐可以成为工程化大肠杆菌生物化学生产的潜在原料。

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