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辐射诱导的双链断裂可在无广泛切除的情况下发生重组修复

01

文章背景简介

BACKGROUND INTRODUCTION

修复双链断裂(DSB)的机制一般有两种,一种涉及重组以精确地恢复断裂区域中的遗传信息,另一种是易错的末端连接,可能与断裂末端之间的微同源性关联。末端切除通常被认为是在两种修复机制之间选择的关键决定因素。虽然切除通常被认为在DSB重组修复中起关键作用,但目前还没有直接评估“脏”DSB(例如辐射诱导的DSB)的切除量与修复效率之间关系的研究。在“干净”的DSB(例如通过HO内切酶或I-SceI内切酶诱导发生的DSB)处切除被描述为是两步过程:其中MRX(萌芽酵母中的Mre11 / Rad50 / Xrs2;哺乳动物细胞中的MRN)和Sae2(CtIP)的作用仅限于最初的短切除步骤(<50–100个碱基),然后由Exo1和/或Sgs1 / Dna2的组合进行广泛切除,可跨越数千个碱基。在没有MRX或Sae2的情况下,Exo1或Sgs1 / Dna2可以启动切除——尽管这一作用的效率较为低下。

电离辐射(IR)是DSB的常见来源,也是癌症治疗中使用的最常见的试剂之一。IR-DSB的切除速率约为每小时1-2kb,并且基于恢复染色体数量的增加,基因组中近50%的IR-DSB在半小时内修复。

美国国家卫生研究院James W. Westmoreland等人2019年在《Nucleic Acids Research》(IF 11.147,生物1区)发表了题为“Recombinational repair of radiation-induced double-strand breaks occurs in the absence of extensive resection”的研究。研究了在没有大范围切除的情况下辐射诱导的双链断裂发生重组修复。

02

所用到的主要方法

METHODS

1.脉冲电泳实验

2.southernblot转移杂交

3.DSB的量化

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文章主要内容摘要

ABSTRACT

重组修复在双链断裂(DSB)诱导后提供精确的染色体修复。虽然所有DSB重组修复模型都包括5-3切除,但目前还没有研究直接用于辐射(IR)诱导的“脏”DSB随机细胞中G-2期姐妹染色单体修复所需的切除。本研究使用脉冲场凝胶电泳移位方法确定了WT和EXO1核酸外切酶或Sgs1解旋酶的突变体在IR-DSB处的切除。缺少二者任何一个会使得切除长度减少一半,但并没有减少DSB修复水平或细胞存活率。在Exo1Δsgs1Δ双突变体中,几乎检测不到切除,但只需要额外的一个小时就能达到与WT相当的修复水平,并且对细胞生存率只有2成的剂量有调节效果Dnl4缺失菌株的结果表明,剩余的修复不是由于末端连接。因此,与单个干净的HO诱导的DSB相似,切除长度的严重缩短对G2阻滞细胞中多个“脏”的DSB的再配对仅产生轻微的影响。值得注意的是,这项研究首次将DSB的切除长度与姐妹染色单体之间的全局重组修复能力直接联系起来。

本研究首次演示了IR-DSB诱导姐妹染色单体之间的分子重组体,这通过线性二聚体分子的产生来证明,这也包括重组体可能是如何形成的描述。实验表明在DSB的两端有一致的切除起始,这是由于末端之间的切除的协调。MRX已被证明在确定的DSB处开始切除,随后通过Exo1或Sgs1/DNA2进一步广泛切除。核酸酶的丢失减少了单个“干净”DSB的切除,导致通过单链退火减少了对放置在直接重复之间的单个“干净”DSB的修复。本文研究表明缺少Exo1或Sgs1/DNA2会导致IR-DSB的切除率降低一半,而对DSB修复几乎没有影响。Exo1和Sgs1/DNA2的联合丢失导致几乎检测不到的IR-DSB切除水平。尽管如此,DSB的修复或存活率只有相对较小的降低,这表明在对照组细胞中的切除比修复或产生重组二聚体分子所需的切除要多得多。重要的是,本研究证明了低切除修复是由于重组而不是末端连接。这些结果得出了一个耐人寻味的可能性,酵母和脊椎动物中DSB的重组修复可能在机制上比以前认识到的更相似。

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