附图1D：在患者标本中对于所有细胞的聚类结果

对于无法通过自举分析分离的的生物学相关亚型（例如，来自肿瘤和肿瘤周围组织的淋巴EC），作者根据先前的研究，确定它们在统计学上是可以使用成对差异分析来分离的。13个表型中的每一个都按图1C所示编号（H1，H2等）。

作者根据hPNEC和hTEC中排名最高的标记基因的相对丰度对亚型进行生物学注释，并对显著的标记基因表达水平差异进行统计量化以支持定性生物学注释（图1D–1G和S1E）。

图1D：t－SNE聚类后的亚群标记基因的表达分布情况 

E：标记基因在不同亚组中的表达热图 

F：在hTECs和hpNECs不同EC亚型的占比 

G：每种亚型在hTEC和hpNEC中的占比情况

为了获得更可靠的解释，作者关注不同亚型的特异基因集并基于规范的基因集（表S5）对亚型进行分析。为了提高分析的通用性，所有聚类的分类都被分析了至少一次。

作者对先前记录亚组中排名最高的标记基因作用的详细描述，用于推断每个亚型的假定生物学作用。

表S5（部分）：用于定义聚类的基因集

作者对于每一个聚类的通过其高表达基因集进行了生物学功能的分析：

动脉EC（簇H1）表达的基因涉及血管完整性，体内稳态和血管收缩（图2A），而毛细血管后静脉EC（H2）表达的基因与白细胞募集，组织灌注和肺动脉血压有关（图2B）。

作者确定了I型（H3）和II型（H4）肺泡毛细血管EC表型，其特征在于血管性血友病因子（vWF，II型相比I型上调；倍数＝ 3．63，adj．p＜0．001）和黏蛋白（EMCN，I型与II型相比上调；倍数＝ 2．89，adj．p＜0．001），它们可能分别参与血管调节和抗微生物防御（图2C–  2E）。

与所有其他簇相比，毛细血管内皮细胞表达了参与MHC－II介导的抗原呈递和加工的基因，其表达水平高于其他表型（图2F），但共刺激分子CD80和CD86却未检测到，提示其具有专职抗原呈递细胞（APC）的功能。

确定了2种可能由肿瘤源性细胞因子诱导的新型毛细血管表型：清除毛细血管（scavenging capillaries ）（H5）在自举分析结果中显示出类似于II型毛细血管内皮细胞的特征，而其清除受体和与巨噬细胞及抗原加工相关的基因上调表达（图2G，2H 和S1D），激活毛细血管（H6）则表达EC激活标记（图2I）。

中间毛细血管EC表型（H7）类似于活化的毛细血管，但其主要由单个患者衍生的细胞组成。

图2：肺正常组织EC各亚型的基因表达差异情况

作者随后探究了在肿瘤组织中特异性的EC，结果显示：

传统的血管生成表型，例如tip和增生的EC（假定为抗血管生成治疗［AAT］的靶标），仅在hTEC中可检测到（图3A，S1E和S2A）。tip EC（H8）与EC迁移，基质重塑和血管内皮生长因子（VEGF）信号传导相关的基因特征相关（图3B），但其仅在少数（＜10％）hTEC中被检测到（图S1E）。

值得注意的是，tip hTECs显示出疾病特异性分子PGF（胎盘生长因子；PlGF ）的高度限制表达。

发现了一个不成熟的hTEC表型（H9）与tip  EC相似，但是其上调的基因参与了新生血管的成熟，血管屏障完整性和Notch信号转导，作者推测其可能类似于茎状EC（图3C和S1D） 。

仅在一部分患者中检测到增殖的hTECs，占hTECs的＜1％，并且在批量校正后不再作为单独的簇被检测到（图S2A）。

在hTECs中，激活的毛细血管后静脉表型（H10）上调表达了免疫调节因子和核糖体蛋白（图3D），这是发炎组织中高内皮小静脉（HEVs）的特征。

与血管内皮细胞广泛的表型异质性相反，肿瘤和肿瘤周围淋巴内皮细胞（LEC；H11，H12）的基因表达特征高度相似，并且未检测到LEC亚群（图3E和S1）。

图3：A：hnNEC与hTEC之间的EC表型差异 

D－C：不同EC之间的基因表达差异

附图2A：各样品中增殖EC的存在情况

为了探索本研究中采用的NSCLC EC分类标准的通用性，作者使用了排名最高的标记基因来训练机器学习算法，以自动注释方式从来自5位未接受过治疗的NSCLC患者（公开数据集）的肿瘤的52，698个细胞目录中以计算机方式注释574个hPNEC和638个hTEC。大多数EC分类具有高置信度注释（相似性阈值＞ 0．5）（图3F），这表明分类法是外部有效的。

图3F：将hTEC和hPNEC表型与组织分类相关联的桑基图

作者使用正交技术以验证分类法的可靠性，通过免疫染色结合定量RNA杂交计数转录本数期望证实CD31 ＋ ／ CXCR4高tip hTECs中的PGF水平被上调

免疫染色：

三重免疫染色显示CXCR4和PlGF在TEC中共定位（图3G和3H； S2B）。

SELP的免疫染色证实了激活的毛细血管后静脉EC的特征（图S2C和S2D）

vWF和EFNB2分别为静脉和动脉表型（图S2E–S2H）

HEV特异性MECA－79抗原是HEV表型的特征（图S2I）

图3G：细胞中转录本PGF和CXCR4的表达情况及计数

图3H：NSCLC肿瘤血管的RNAscope图像（CXCR4（白色）PGF（绿色）CD31（红色）细胞核（Hoechst））

附图2B：对CD31，PLGF和CXCR4免疫染色的人NSCLC肿瘤切片的代表性显微照片

附图2C－H：NSCLC肿瘤切片（左）正常肺（右侧）的免疫荧光照片 

I：对CD31和MECA79免疫染色的人NSCLC肿瘤切片照片

RNAscope：

RNAscope结合EC标记CD31的染色显示，动脉（EFNB2）和静脉（ACKR1）标记转录本不在同一hTEC中共定位（图S3A和S3B）

活化毛细血管hTECs表达了标记CCL14（图S3C）。

清除毛细血管标记CD52和CD68以及I型毛细管标记EDNRB和IL1RL1的转录本共定位在同一hTEC中（图S3D和S3E）。