NRP1对CD8＋T细胞的影响

与NRP1在小鼠胸腺来源的Treg细胞上的结构性表达不同，其在原始CD8＋T细胞上的表达是检测不到的（无论是小鼠还是人类），其只在T细胞激活时才被诱导。CD8＋T细胞对NRP1的转录上调是在使用LCMV特异性（P14）TCR转基因T细胞对CD8＋T细胞分化的早期分子和功能分析中首次发现的，其中NRP1转录在效应CD8＋T细胞和效应器到记忆的过渡期达到峰值。Nrp1上调与一组编码参与T细胞迁移和粘附的蛋白质的基因相一致，如CCR5、CD44和p－选择素糖蛋白配体1（PSGL－1）。这就提出了一个问题：NRP1是否也像在神经元或内皮细胞中一样调节CD8＋T细胞的迁移。与这一发现相一致，研究人员还观察到多克隆肿瘤内效应CD8＋T细胞以及激活的肿瘤抗原特异性CD8＋T细胞上NRP1表达的上调（包括转录和蛋白水平）。因此，TCR参与似乎是推动NRP1在CD8＋T细胞中表达的必要条件，这是大多数已知的T细胞共受体所共有的特征。然而，尽管观察到上调，NRP1在CD8＋T细胞早期启动过程中的功能作用尚不清楚。

一些早期观察表明NRP1可能是CD8＋T细胞中的一种IR样分子。它首先在免疫抑制的肠道CD8＋T细胞亚群（Foxp3＋CD8＋Treg细胞）以及已知与CD4＋Treg细胞相关的分子（如PD1和CD103）上被高度诱导。这些CD8＋Treg细胞可能通过下调T细胞的效应器功能来维持体内稳态。在随后的报告中，使用Gag特异性（TCRGag）CD8＋T细胞来了解调节CD8＋T细胞耐受性和免疫性的细胞内在机制，经测定，和PD1、LAG3和CTLA4一样，NRP1优先表达于耐受性、自反应性CD8＋T细胞上，尽管NRP1对于耐受性是不必要的。另外的证据表明NRP1可能在T细胞功能障碍中起作用，T细胞功能障碍是指由于缺乏共刺激或持续的抗原暴露而导致T细胞缺乏营养或衰竭。T细胞功能障碍表现为高IR共表达和效应标记物表达减少，研究发现NRP1属于上述所有T细胞功能障碍状态共有的174个基因的核心转录特征。

事实上，最近的一项报告表明，CD8＋T细胞NRP1在小鼠和人类中的表达仅限于以PD1高表达为标志的肿瘤内CD8＋T细胞亚群，而在PD1－瘤内CD8＋T细胞上检测到NRP1＋T细胞最少。与NRP1－PD1－和NRP1－PD1＋对应物相比，NRP1＋PD1hi细胞表现出较高的经典IRs（如LAG3、TIM3、TIGIT、2B4）以及与细胞增殖相关的标记物（如Ki67）和细胞毒性（如Granzyme B）。它们还表达较高水平的耗竭相关转录因子，如NFATc1、TOX、Blimp1和IRF4，但与细胞存活（Bcl2）和记忆／衰竭前体细胞（TCF1）相关的基因水平降低。这非常容易令人想起在慢性病毒感染和肿瘤模型中定义的“终末期衰竭”CD8＋T细胞。重要的是，NRP1在功能上参与了肿瘤内CD8＋T细胞的终末衰竭，而不仅仅是这种功能障碍状态的后果。具体而言，从B16F10肿瘤中回收的CD8＋T细胞经中和抗NRP1抗体处理后，表达更高水平的穿孔素和颗粒酶B（介导CD8＋T细胞毒性活性的关键分子），并且对体外自体肿瘤细胞表现出更强的细胞杀伤作用。在同一研究中，体内NRP1阻断导致肿瘤生长减少，这与PD1阻断进一步协同作用，尽管这种协同作用在体外没有观察到增强的细胞毒性活性。体内和体外的差异可能是由于通过阻断Sema3A–NRP1轴来增强新近激活的CD8＋T细胞的肿瘤募集。重要的是，在体内抗NRP1方案下，除了CD8＋T细胞外，阻断NRP1对细胞类型（如Treg细胞）也可能有贡献。实际上，后者似乎得到了利用CD8＋T细胞特异性Nrp1缺陷小鼠株（E8ICreNrp1L／L）的研究的支持，这种小鼠的原发肿瘤生长与野生型相似。然而，在E8ICreNrp1L／L小鼠中，还观察到在MC38结肠腺癌模型中，Nrp1基因敲除和PD1阻断之间存在明显的协同作用，进一步支持了Nrp1有助于缺陷的CD8＋T细胞介导的原发性肿瘤控制，尽管作用是间接的。

事实上，E8ICreNrp1L／L小鼠最显著的表型是在术后肿瘤免疫小鼠模型中，它们对继发性肿瘤的作用增强。这项观察表明，NRP1在CD8＋T细胞中的主要作用可能是它有助于缺陷的CD8＋T细胞介导的抗肿瘤免疫记忆。具有临床意义的是，这种模式类似于癌症患者疾病复发的控制。进一步的研究显示，Nrp1–／–肿瘤内CD8＋T细胞更能维持类似干细胞的记忆／衰竭性T细胞祖细胞表型，而不是最终衰竭T细胞表型的不可逆分化。因此，这些Nrp1–／–记忆前体形成了一个更大的肿瘤特异性记忆CD8＋T细胞池，这种情况在通过基因缺陷或抗体在阻断任何其他IRs时都没有报道。

与效应CD8＋T细胞相比，NRP1在记忆性CD8＋T细胞上的表达在不同的研究中有很大差异。在急性病毒感染期间，与效应T细胞相比，长效记忆细胞的Nrp1基因转录下调（尽管比原始细胞高）。这种Nrp1表达下调在肿瘤特异性记忆CD8＋T细胞上更为显著，其中Nrp1转录在初始细胞中降低到基线水平。与这些观察结果相反，一份报告将NRP1描述为在非炎症条件下通过肝窦内皮细胞交叉呈递抗原产生的肝启动记忆CD8＋T细胞的表面标记物，然而，对于这些记忆性CD8＋T细胞来说，这在功能上是不必要的。这些研究之间的差异可以部分地由产生功能性记忆的不同体内条件（例如炎症环境和抗原类型）来解释。因此，NRP1在记忆CD8＋T细胞（其他IRs可能也一样）上的表达是由记忆形成过程中的环境决定的。

综上所述，NRP1在CD8＋T细胞中的进化生物学支持了存在独立的IRs或免疫“检查点”的假设，它们分别控制肿瘤内CD8＋T细胞的效应和记忆功能。进一步的机制解释这一假设是至关重要的，希望可以提高T细胞靶向免疫治疗的持久性，包括免疫检查点阻断和过继T细胞转移。

NRP1靶向治疗肿瘤：新一代的检查点分子

NRP1的临床研究主要集中在其作为VEGFR2的共受体对肿瘤血管生成的贡献上，而不是通过结合信号素或其他配体的免疫调节功能。抗NRP1单克隆抗体（MNRP1685A）的初始药代动力学研究表明，与抗VEGF－A的bevacizumab联合使用，可有效抑制人血管内皮生长因子途径。然而，随后在I期研究中进行的安全性分析显示出高水平的不良事件，最显著的是2级或3级蛋白尿出现在超过50％的受试者，最终终止了对这种药物的治疗研究。最近对抗VEGFR2药物ramucirumab的调查发现，对Treg细胞有显著影响，为推测NRP1功能和表达是否对观察结果有贡献留下了空间。

迄今为止，只有一种抗NRP1单克隆抗体被临床评估其对Treg细胞功能的抑制作用。ASP1488（人IgG4，Astellas Pharma Inc．）联合Nivolumab正在进行Ib期评估（NCT03565445），用于晚期实体瘤患者。这项试验的结果预计将在2022年得出，这将是进一步评估靶向NRP1的临床意义和潜力的关键。免疫监测Treg细胞和CD8＋T细胞的变化，即使是在病人的外周，也可以为治疗反应和作用机制提供信息。

除此之外，对NRP1靶向治疗的潜在结果的观察也可以间接地从研究信号素家族（涉及其免疫调节的主要NRP1配体群）的靶向治疗上获得。为此，尽管T细胞上NRP1的主要配体Sema4A尚未在临床上被靶向，但是针对Sema3A（已知的NRP1配体）的药物的临床前评估已经取得了令人满意的结果。Sema3A被认为是一种血管系统正常化因子，它与NRPs和丛蛋白相互作用。尽管多项研究表明Sema3A的功能抑制肿瘤细胞生长和迁移，但是最近一项针对胶质母细胞瘤的研究表明，在患者衍生的异种移植（PDX）模型中，Sema3A的中和作用阻碍了肿瘤的生长。这些发现之间的差异仍有待研究；但是，不同肿瘤类型的肿瘤血管需求和免疫浸润的差异可能决定了Sema3A是否具有促肿瘤或抗肿瘤功能。事实上，Sema3A内在调节T细胞激活，因此，治疗性阻断这种相互作用可能介导增强的抗肿瘤免疫。

已有的小分子或肽拮抗剂主要针对b1结构域与VEGF－A的相互作用，以减少肿瘤细胞的迁移和血管生成，而新的候选药物似乎还可以在体外内在地调节Treg细胞的功能，这种组合作用可能允许降低剂量来减轻潜在的副作用。尽管人类Treg细胞在肿瘤中选择性地表达NRP1，使其成为一个有吸引力的肿瘤特异性免疫靶点，但NRP1是由造血细胞和非造血细胞亚群（包括pDCs和内皮细胞）结构性表达的。因此，靶向NRP1的药物在稳态和疾病状态下对这些细胞类型功能的影响将进一步确定其临床适用性。

展望

越来越多的文献表明，NRP1是癌症免疫治疗中一种独特的免疫调节剂。在TME中，NRP1内在地调节Treg细胞和CD8＋T细胞功能，共同阻碍抗肿瘤免疫，并与多个IRs同时表达。NRP1有利于肿瘤内Treg细胞的功能，这主要是通过促进它们在肿瘤床上的募集和在持续的炎症中增强其功能稳定性。恶性肿瘤患者的NRP1＋Treg细胞丰度较高，治疗干预与外周Treg细胞NRP1表达降低有关。虽然NRP1对CD8＋T细胞效应器功能影响较小，但与其他IRs相比，NRP1对记忆形成和持久反应的影响是不同的。这些新的特点可能转化为与现有标准的检查点抑制剂并不重叠的临床疗效，从而为联合治疗提供了有根据的理论依据。

随着越来越多的对NRP1的免疫调节作用的关注，利用靶向NRP1来改善肿瘤治疗的机会在增加，而关于NRP1基本生物学和转化应用的关键问题仍然存在。

我们能否进一步了解NRP1在T细胞亚群（即Treg细胞、CD4＋和CD8＋T细胞）中的分子基础，特别是在人类中？这些机制的描述对于制定特定的干预策略、促进组合免疫疗法的优化设计以及减少治疗引起的免疫相关不良事件的方法至关重要。

在众多的NRP1配体中，哪一种与肿瘤内的Treg细胞和CD8＋T细胞最相关？这一问题的答案将有助于明确靶向相关肿瘤相关的NRP1－配体相互作用的阻断策略，同时保留NRP1的生理功能。

NRP1靶向治疗方法能否提供新的策略来提高过继性T细胞治疗的持久性，如嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗？在这种情况下，NRP1可能是一个可行的基因靶点，以克服CD8＋T细胞功能障碍，并提高体内反应持续时间。

NRP1拮抗剂对TME中包括APCs和间质细胞在内的其他细胞的功能有内在的影响吗？如果是这样的话，是否有增强抗肿瘤免疫的作用？

与标准的免疫检查点治疗相结合，如抗PD1／PD－L1抑制剂，是否能达到更好的临床疗效？最佳给药方案是什么？

人外周血T细胞（Tregs或CD8＋细胞）上的NRP1能否作为诊断肿瘤的标志物？它能被用来确定免疫治疗的最佳候选者或评估治疗效果吗？

参考文献：

Neuropilin－1： a checkpoint target with unique implications for cancer immunology and immunotherapy． Trends Immunol． 2020 Jun；41（6）：493－511