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文章背景简介  

BACKGROUND INTRODUCTION

天冬酰胺连接（N－连接）蛋白糖基化是真核生物中最常见的翻译后修饰之一，它影响着蛋白质的特性，如折叠、稳定性、免疫原性和药代动力学。附着在糖蛋白的N－聚糖可以参与生物过程，如免疫识别反应和干细胞分化。而且，蛋白质相关聚糖的改造工程可用于操纵蛋白相关的修复特性，如增强胞内的活性和半衰期。

目前，聚糖固有的结构复杂性、生产糖基化蛋白的潜在困难，限制了人们对糖蛋白功能的研究进展。此外，由于聚糖的生物合成既不是模板驱动的，也不是基因编码的，因此聚糖不能通过重组DNA技术产生。相反，N－聚糖是通过多个糖基转移酶在多个亚细胞室中的协调表达而自然产生的。这种生物合成模式加上缺乏严格的校对系统，导致了固有的聚糖异质性，并造成了细胞或生物体所表达的聚糖库中结构的巨大多样性。而更复杂的问题是，糖基转移酶的结构与功能之间的关系研究相对缺乏，这就是的聚糖结构预测及其生物合成更加困难。

近年来，细菌糖工程这一研究方向的再次兴起，使得生产设计聚糖和糖缀合物作为疫苗和治疗方法逐渐成为可能。然而，由于细胞活力的限制和无法在体内以精确的比例控制糖基化成分，基于细胞的糖蛋白生产困难重重。

目前，最具特征和最广泛采用的无细胞蛋白合成系统（CFPS）系统是使用大肠杆菌裂解物来实现体外蛋白质合成，但因为大肠杆菌缺乏内源性糖基化机制，这些CFPS系统无法制造糖蛋白。

一些真核CFPS系统中可以进行糖基化，包括昆虫细胞、杂交瘤细胞或哺乳动物细胞等。然而，这仅限于进行糖基化的内源性机制。此外，真核生物的CFPS系统在技术上难以制备，通常需要补充微粒体，并且由于新生多肽链向微粒体的运输效率低下，导致蛋白质合成和糖基化产量效率低下。

2018年美国西北大学的Thapakorn Jaroentomeechai在《Nature Communications》（中科院一区，IF＝14．919）发表题为“Single－pot glycoprotein biosynthesis using a cellfree transcription－translation system enriched with glycosylation machinery”的文章。这项工作研究了一种新的无细胞糖蛋白合成（CFGpS）技术，该技术无缝地将蛋白质生物合成与天冬酰胺连接的蛋白糖基化相结合。该技术利用优化了的富含糖链的大肠杆菌细胞提取物，选择性地富集糖基化成分，包括寡糖转移酶（OSTs）和脂联寡糖（LLOs）。所得到的提取物可以进行一锅式的的高效反应并且进行位点特异性的糖基化。

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文章主要内容摘要

ABSTRACT

基于大肠杆菌的无细胞翻译系统具有开放性，使得糖蛋白在CFPS的合成具有可能性。该小组最近的一项研究在基于大肠杆菌的CFPS中通过纯化的糖基化组分实现了N－糖基化途径，使大肠杆菌的无细胞系统具有合成糖蛋白的能力。

虽然这些结果建立了基于大肠杆菌提取物生产糖蛋白的可能性，但使用纯化的糖基化成分存在几个缺陷，限制了系统的效用。首先，糖基化成分的制备需要耗时且成本高昂的步骤，即纯化多通道跨膜寡糖转移酶和基于有机溶剂从细菌膜中提取脂联寡糖供体。这些步骤大大延长了工艺开发时间，准备LLO和OST组件各需要3－5天，需要熟练的操作人员和专业设备，导致产品必须冷藏，只能稳定几个月到一年。糖蛋白生产顺序需要遵循先翻译后糖基化这一策略，这需要20小时的靶蛋白合成，另外12小时的翻译后蛋白糖基化。在这里，本文通过开发一种集成的无细胞糖蛋白合成（CFGpS）技术来解决这些缺陷，该技术绕过了OSTs的纯化和基于有机溶剂的LLOs提取的需要。这种流水型CFGpS系统的创建是由于两个重要的发现：（1）从优化的大肠杆菌菌株CLM24中提取的粗提物能够支持无细胞蛋白表达和N－连糖基化；（2）从CLM24中提取的OST和富含LLO的提取物能够重复地共激活蛋白质合成和N－糖基化，该反应混合物至少需要用编码目标糖蛋白的DNA启动。重要的是，CFGpS系统分离了糖蛋白合成成分（即OSTs、LLOs、翻译机制）和感兴趣的糖蛋白靶点的产生，与体内系统相比，显著降低了细胞活力的限制。最终的结果是获得了一个一锅式细菌糖蛋白生物合成平台，通过这个平台，不同的受体蛋白、OSTs或寡糖结构可以在功能上进行交换，并可为糖基化的形成定制原型。本研究建立的CFGpS将促进糖科学的进一步理解，并在糖蛋白的按需生物制造方面得以应用。

       原文标题 : 无细胞系统+糖基化机制，实现“一锅式”糖蛋白生物合成