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引言

抗体与其靶抗原的结合动力学是决定其生物学功能和作为新型生物治疗药物成功的关键因素。定义抗原抗体的相互作用和动力学对于理解抗体在治疗应用中的药理学和药效学特征至关重要。

抗体的功能与其结构直接相关，不同的结构域能够与抗原和免疫系统的其他元件相互作用。天然抗体由两个片段抗原结合结构域（Fab）和一个片段可结晶结构域（Fc）组成。Fab结构域包含互补决定区（CDR），其通过非共价相互作用介导抗体与靶标的结合。传统上，两个抗体臂上的CDR是相同的，但目前已经开发出多种新的形式，包括双特异性抗体、三特异性抗体、抗体偶联药物（ADC）和免疫细胞因子等。

精准确定抗体结合相互作用是早期发现工作的关键，靶点的性质和候选抗体的适应症应用可能决定亲和力要求和靶点作用机制。与小分子不同，抗体可以与几个治疗靶点（包括Fc受体）相互作用，导致免疫效应细胞的募集和激活，直接消除表达靶抗原的细胞。抗体还可以通过模仿天然多价配体、驱动受体聚集和反激活来诱导激动作用。这些不同的作用机制和日益复杂的新型抗体形式的出现，使抗体亲和力和功能效力之间关系的研究成为一项复杂的任务。

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一、抗体结合亲和力与功能性亲和力

结合亲和力（affinity）代表了两个分子之间结合的紧密程度。它来源于结合和解离的速率，定义了复杂结构的组装和分解的速度。在抗体的背景下，靶结合亲和力是指CDR与其抗原表位之间的相互作用，它来自抗体与靶标解离速率常数（Koff）和结合速率常数（Kon）的比值。

结合亲和力也可以来自其他抗体结构域，如Fc区。由于这些恒定结构域的高度序列同源性，相互作用强度通常是一致的，主要在抗体同种型或Fc受体多态性之间观察到显著差异。抗体对其抗原的亲和力和特异性是由非共价相互作用驱动的，包括氢键、范德华力和抗体CDR中氨基酸残基介导的静电相互作用。具有相似结合亲和力的抗体可能具有不同的动力学。因此，在考虑观察到的治疗效果时，了解影响KD值的个体动力学速率常数是非常重要的。

由于抗体的二价形式，抗体同时与两种不同的抗原结合，这一概念被称为功能性亲和力（avidity）。功能性亲和力代表抗体-抗原相互作用的整体强度，受三个因素的影响——结合亲和力（Affinity）、价数和抗体与抗原的结构排列。功能性亲和力来源于结合位点的共定位，抗体的两个CDR结合到同一靶标上，如细胞膜上的抗原。这可以表现为结合亲和力的明显增加，这是由增强的再结合潜力引起的，因为第二个Fab：抗原相互作用可以在主要复合物解离之前发生。

亲和力增加可能出于两个原因。首先，抗体的两个臂都与空间相关的位点结合，为了完全解离，两个臂必须释放其抗原，导致有效的解离半衰期比单独的抗体臂长得多。其次，当与细胞表面相关抗原结合时，抗体在空间上受到限制。一个潜在的后果是，第二次结合事件是由细胞表面上第二拷贝抗原的局部可用性来决定的。因此，功能性亲和力可以被视为一种协同作用，其中一个臂的结合会导致另一个臂结合动力学的变化。细胞膜上更高有效抗体浓度的亲和力效应将取决于细胞密度和抗原表达水平。

当目标是最大限度地提高靶参与度，以拮抗靶抗原的生物功能时，功能性亲和力可能是有利的。然而，当目标指向免疫系统时，如ADCC和ADCP，这种抗体二价的作用是非常有限的。实验观察表明，单价或具有较低内在亲和力的工程抗体可能更有效，表现出明显增加的Emax，这是由于与细胞膜结合的抗体增加。

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二、抗体-抗原相互作用的调节

近年来，人们已经探索出几种调节抗体靶点结合的方法。通过提高抗体亲和力或改变价态并引入额外的功能域来实现抗体与靶点的更强结合。

抗体序列工程化调节抗体靶亲和力

抗体亲和力调节的最早时间点是在抗体发现阶段。传统上，抗体亲和力的调节可以通过体外噬菌体、酵母和哺乳动物基于展示的抗体发现模型来实现的。亲和力调节可以通过使用这些方法进行亲和力成熟来实现，引入突变以产生具有操纵靶结合亲和力的突变库，此外，可以通过引入更苛刻的洗涤条件来选择高亲和力抗体。

此外，通过体内技术可以实现的高亲和力抗体的发现。通过调节免疫方案，包括免疫抗原、佐剂、预处理、免疫方案、给药途径和靶生物的形式，以最大限度地刺激高亲和力抗体的产生，然后通过B细胞克隆技术筛选高亲和力抗体。进一步的创新包括使用表达人源抗体的转基因动物，这些抗体能够以高亲和力结合靶点，并具有更大的临床转化前景。

基于AI的亲和力优化

二代测序（NGS）通过基于序列相似性和特征识别可能编码高亲和力抗体的核酸，增强了对高亲和力抗体发现的能力，允许以前所未有的规模筛查编码核酸的抗体。此外，人工智能和基于机器的学习（AI/ML）增强了NGS以更高的精度筛选更多高亲和力结合序列的能力，并证明了其在抗体、基因聚类、从头设计、优化和调节结合亲和力方面的能力。

通过抗体结构工程化调节靶点结合

除了靶亲和力之外，通过改造天然单特异性形式之外的结构，可以增强抗体与靶的结合，包括在单个分子内配对两组不同的CDR以产生双特异性抗体。此外，功能结构域的引入导致了更复杂的形式的发展，如三特异性抗体和免疫细胞因子。

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三、测量抗体-抗原相互作用的方法

准确测量抗体亲和力，理解结合动力学，可以有效指导药物开发。抗体-抗原互相作用的测定方法大致可以分成两大类：一类是把其中一个分子（通常是抗原）固定在芯片或者板子上，然后测定另一个分子（抗体）的结合参数，比如SPR、BLI。另一类是直接在活细胞上做实验，看抗体怎么结合到细胞表面，比如流式细胞术、KinExA等等。

表面等离子共振（SPR）

SPR被广泛用于实时测量抗体与固定抗原、补体或Fcγ受体的结合动力学。这种高通量、无标记的技术提供了对抗体-抗原结合动力学的详细分析，包括结合率和解离率。通过固定任一结合伴侣。结合和解离事件会改变固定分析物的金膜芯片的折射率，从而导致可以实时测量的光散射强度的变化。

然而，在将体外和体内发现相关联时，SPR可能缺乏生理相关性。固定化的细胞表面抗原可能无法在细胞膜内准确复制其三维结构，溶液中的天然抗原相互作用受到固定化的限制，从而限制了观察到的相互作用自由度。此外，SPR中使用的缓冲条件可能无法准确反映pH、温度或成分方面的生理结合环境。

流式细胞术

细胞计量学细胞结合试验用于针对固定数量的表达靶抗原的细胞进行抗体滴定。这些检测使用荧光标记的配体或标记的第二抗体来检测结合，从而可以确定达到半数结合的浓度（EC50）和最大结合，这可以提供对抗体结合机制的见解。

设计细胞结合方法时有几个考虑因素，包括配体耗竭和平衡。基于细胞术的检测的其他局限性包括抗原：抗体复合物内化，导致观察到的抗体结合减少。

动力学排斥试验

动力学排斥试验（KinExA）是一种基于溶液的试验，用于确定免疫复合物的结合伴侣浓度和平衡解离常数。在抗体亲和力测量中，靶抗原被恒定浓度的抗体结合位点，使其平衡，随后在流动中暴露于抗原包被的珠粒中。用荧光偶联的二抗检测珠捕获的抗体，从而能够在平衡时定量游离抗体并测定抗体亲和力。由于这种测定通常可以达到平衡，因此被认为更适合测量高亲和力、亚纳摩尔的相互作用。

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四、抗体亲和力与功能的关系

抗体对其靶标的亲和力通常被认为与其诱导药理作用的能力密切相关。然而，这种相关性并不完全是线性的，并且高度依赖于所讨论的特定药理作用，以及它是否是由于靶细胞表面的靶占据或抗体密度引起的。

紧密结合及其对抗体功能的影响

高亲和力抗体通常会与其靶抗原表现出“紧密结合”，其特征是当抗体浓度远低于抗原浓度时，仍能有效结合，导致游离抗体被耗尽。通常抗体亲和力与其药理学效果密切相关，但亲和力与功能的关系并非总是简单的线性关系，其取决于具体机制和效应来源。

拮抗性抗体

拮抗性抗体通过直接受体结合或隔离激活配体来破坏受体信号传导。可以通过观察靶受体激活的下游效应来评估它们的功能，包括从测量信号事件（如配体结合后不久的受体磷酸化）到对细胞增殖或表型的下游影响。通常靶标亲和力和效力之间呈线性关系，更高亲和力的抗体能够在较低浓度下引发它们的作用。此外，这里可能存在一些表位依赖性，因为与受体结合结构域结合的抗体比与更远端表位结合的抗体更有效。

免疫细胞接合器

参与抗体的免疫细胞涵盖了广泛的作用机制，所有这些机制都会诱导靶细胞的细胞毒性，例如通过ADCC、ADCP或CDC。除了这些传统的Fc介导的效应器功能外，还包括了T细胞和NK细胞结合器，通过Fab介导的靶向特定效应细胞免疫受体来招募免疫细胞。

通常在这些复杂的作用机制中，亲和力和功能之间的关系并没有明确界定，其中抗体靶结合与补体或FcγR结合和/或免疫细胞结合是同时需要的。对于Fc依赖性细胞毒性机制，高亲和力抗体可能导致双价结合，占用两个抗原但只提供一个Fc，降低效应细胞募集效率。相比之下，亲和力较低的抗体更有可能以单价结合，导致更大的细胞调理、Fc呈递，从而导致免疫细胞和补体募集。

双特异性T细胞和NK细胞接合器的功能活性受TAA和T/NK细胞靶向域亲和力的调节。对TAA的亲和力必须足够高才能与靶标结合，但必须仔细考虑对CD3的亲和力，以平衡细胞毒性作用，同时降低与细胞因子释放相关的风险。

激动剂抗体

激动剂抗体利用其二价性质促进其靶标在靶细胞膜或溶液中的聚集。通过这种方式，它们可以模仿天然存在的配体，诱导受体激活或靶标交联。

抗体亲和力和激动活性之间的关系尚未像拮抗抗体那样得到广泛的研究。一项研究调查了靶向三种不同受体（PD-1、CD40和4-1BB）的激动性抗体的亲和力和功能关系，这些受体需要聚集才能引发其激动活性。该研究表明亲和力和功能之间存在钟形关系，低亲和力而非高亲和力是由更快的解离速率驱动的，导致最大的激动作用。此外，还观察到除亲和力之外的抗体的其他特性会影响体外效力，包括铰链灵活性和对Fab构象的影响。

抗体偶联药物

ADC的结构很复杂，其功效受到其物理化学性质和生物学特征的影响，如细胞内化、有效载荷释放和有效载荷的作用机制。连接子-有效载荷与抗体的结合，无论是通过共价还是非共价修饰，都会改变ADC的物理化学特性。

一般来说，高亲和力可能提高细胞内吞和载荷释放效率，但也可能增加脱靶毒性。而低亲和力可能减少脱靶结合，但也可能降低肿瘤细胞摄取效率。亲和力的选择需要平衡靶向性、内吞、载荷释放和安全性等各方面。

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结语

抗体结合定量技术的快速发展为精准治疗和药物研发开辟了新的可能性。通过对抗体亲和力与功能性亲和力的深入理解与优化，结合AI技术、序列工程和功能域设计，我们不仅能够提升抗体的治疗效力和靶向性，还能显著降低副作用风险。未来，随着跨学科技术的融合与创新，抗体疗法有望在癌症、自身免疫疾病和感染性疾病等领域实现更突破性的进展，最终为患者提供更安全、更个性化的治疗方案。这一领域的持续探索，将深刻影响生物医药的发展方向与临床实践。

参考资料：

1.Quantifying antibody binding: techniques and therapeutic implications. MAbs. 2025 Feb 16;17(1):2459795

       原文标题 : 抗体结合定量的技术进展与治疗意义